Withania somnifera (L.) dunal entera

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 11047 (2022) Citar este artículo

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Withania somnifera (L.) Dunal (Ashwagandha) se utiliza ampliamente en los sistemas de medicinas Ayurveda, Unani y Siddha debido a su aplicación terapéutica en numerosas dolencias. Tradicionalmente, los medicamentos preparados a partir de la planta emplean únicamente sus raíces y, según la literatura científica actualmente disponible, su eficacia y seguridad están bien establecidas. Además de las raíces, las partes aéreas también contienen componentes bioactivos y, por lo tanto, algunos preparados comercializados también utilizan las hojas de la planta. En consecuencia, el Ministerio de Ayush del Gobierno de la India ha emitido recientemente un aviso que enfatiza la necesidad de elaborar perfiles exhaustivos de eficacia y seguridad de los productos a base de hojas. En consecuencia, hemos llevado a cabo el presente estudio impulsado por GLP, en el que se evaluó la seguridad no clínica de un extracto hidrometanólico de toda la planta de Withania somnifera (WSWPE) de acuerdo con la directriz 407 de la OCDE. En este estudio, ratas Sprague Dawley de cualquiera de los dos sexo se les administró por vía oral WSWPE durante 28 días consecutivos en dosis de 100, 300 y 1000 mg/kg/día. El estudio también incluyó un grupo satélite de animales que recibieron WSWPE durante 28 días seguido de un período de recuperación de 14 días. Se encontró que el extracto de planta entera de Withania somnifera era seguro hasta el nivel de dosis de 1000 mg/kg/día, ya que no se pudieron detectar hallazgos toxicológicamente relevantes.

Withania somnifera (L.) Dunal (hindi: Ashwagandha, inglés: Winter Cherry), perteneciente a la familia Solanaceae, se ha empleado en Ayurveda para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades. Históricamente, su presencia como hierba terapéutica estándar en los sistemas medicinales indios se remonta a miles de años1. Tradicionalmente, las raíces secas de la hierba se utilizan para preparar formulaciones ayurvédicas clásicas y la ciencia moderna también ha validado sus efectos beneficiosos a través de investigaciones basadas en evidencia, centradas en descifrar su mecanismo de acción farmacológico. La actividad farmacológica de Withania somnifera se atribuye a la presencia de varios metabolitos secundarios bioactivos presentes en las raíces2. En estudios preclínicos, una amplia variedad de extractos preparados a partir de las raíces han demostrado actividades anticancerígenas, inmunomoduladoras, cardioprotectoras, neuroprotectoras, antioxidantes, antienvejecimiento, adaptógenas y antidiabéticas3. Con respecto a su actividad neuroprotectora, la administración oral de Withania somnifera, en un modelo animal de enfermedad de Parkinson, mejoró el contenido de catecolaminas del cuerpo estriado y reguló positivamente los receptores de dopamina D2 en el cuerpo estriado2. Estas actividades biológicas se han traducido fructíferamente en eficacias clínicas demostrables en una variedad de trastornos como el hipotiroidismo, la esquizofrenia, el trastorno obsesivo compulsivo, el estrés, la ansiedad, el insomnio, el deterioro cognitivo, la diabetes mellitus tipo 2 y la infertilidad masculina3.

Si bien las raíces o extractos secos se utilizan principalmente para su uso terapéutico, ciertas formulaciones de venta libre también emplean formulaciones a base de hojas. Con respecto al uso de dichos productos comercializados, la Sección de Política de Drogas del Ministerio de AYUSH del Gobierno de la India emitió recientemente un aviso que afirma que actualmente existe una necesidad inminente de evidencia sustancial y literatura científica que pueda establecer de manera inequívoca la eficacia. y seguridad de formulaciones preparadas a partir de hojas de Withania somnifera4. Posteriormente, la generación de datos rigurosos y de alta calidad allanaría el camino para la aceptación regulatoria de las formulaciones obtenidas a partir de las hojas, permitiendo así su uso terapéutico sin reservas. En consecuencia, con estas directivas bien definidas de las agencias reguladoras en mente, informamos por primera vez una evaluación de seguridad no clínica basada en BPL de un extracto preparado a partir de toda la planta de Withania somnifera, que incluye las hojas y otras partes aéreas. partes.

Es imperativo comprender que, además de las raíces, los extractos preparados a partir de hojas y tallo5, bayas6 y semillas de Withania somnifera7 contienen varios componentes bioactivos, que además de las raíces han demostrado actividades farmacológicas preclínicas con potenciales aplicaciones clínico-terapéuticas. Por tanto, además de las raíces, también merecen una mayor investigación clínica las partes aéreas de la planta.

Se ha estudiado ampliamente la seguridad preclínica y clínica de las preparaciones radiculares. Los estudios de evaluación de seguridad no clínicos han revelado un perfil de seguridad aceptable de la raíz de Withania somnifera. Varios estudios de toxicidad aguda, subaguda, subcrónica y crónica han determinado eficazmente que los extractos de raíz son seguros en animales de experimentación tras su administración oral, que es la ruta prevista en sujetos humanos1. Del mismo modo, existe evidencia suficiente de una seguridad clínica adecuada de las preparaciones de raíz en la literatura publicada y hasta la fecha no se han informado problemas graves de seguridad, incluida la alteración de los signos vitales y los parámetros hematológicos y de química clínica. En los ensayos clínicos, todos los eventos adversos informados varían de leves a moderados y son de naturaleza transitoria y se informa que los retiros de los ensayos debido a eventos adversos son insignificantes1.

En nuestra opinión, debido a la similitud de los metabolitos secundarios bioactivos presentes en las raíces y en las partes aéreas de la planta, esperamos un perfil de seguridad comparable entre la raíz y el extracto completo de la planta. Por lo tanto, con el objetivo de respaldar la evaluación de seguridad a largo plazo en roedores, la evaluación de seguridad en no roedores y la posible utilidad clínica del extracto de planta entera de Withania somnifera (WSWPE), hemos determinado su seguridad no clínica de acuerdo con la Organización para la Economía. Cooperación y Desarrollo (OCDE) directriz 4078 y de conformidad con los Principios de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP) de la OCDE. En el presente estudio, se administró repetidamente WSWPE por vía oral a ratas Sprague Dawley de cualquier sexo durante una duración total de 28 días. El diseño de nuestro estudio también incorporó un grupo satélite de animales a los que se les administró por vía oral la dosis más alta del extracto durante 28 días y luego se los observó durante 14 días adicionales sin tratamiento para evaluar la persistencia, reversibilidad o manifestación tardía de los efectos adversos. . El principal objetivo del estudio fue proporcionar evidencia de cualquier toxicidad importante asociada al extracto junto con los órganos diana involucrados y el nivel sin efectos adversos observados (NOAEL) de WSWPE en ratas. Hasta donde sabemos, este es el primer informe que describe la evaluación de seguridad no clínica del extracto de planta completa de Withania somnifera.

La planta entera de Withania somnifera (L.) Dunal se recolectó del Jardín de Hierbas del Instituto de Investigación Patanjali, Haridwar, India, y estaba compuesta por raíces, tallo, hojas, bayas y semillas en proporciones naturales. La planta entera de Withania somnifera se recolectó bajo cumplimiento. con los lineamientos institucionales, nacionales e internacionales. La autenticidad de la muestra de la planta fue certificada por el Consejo de Investigación Científica e Industrial – Instituto Nacional de Recursos de Información y Comunicación Científica (CSIR – NISCAIR), Nueva Delhi, Gobierno de la India, comprobante de autenticación por vídeo número NISCAIR/RHMD/Consult/2019/3453 -54-15; y Herbario de la Fundación de Investigación Patanjali (ver número de acceso 5606). WSWPE (número de lote D4/CHM/SAHA075/1220), un polvo de color marrón que fluye libremente, se generó en el Instituto de Investigación Patanjali, Haridwar, India. Se formuló una suspensión acuosa de WSWPE, destinada a la administración oral a los animales de experimentación, empleando 0,5% de metilcelulosa como vehículo. Todos los demás reactivos y productos químicos utilizados para el experimento fueron de la más alta calidad comercial.

Se extrajeron aproximadamente 10 kg de material vegetal entero seco de Withania somnifera con 75 litros de agua: metanol (1:1 v/v) como disolvente a 70–80 °C durante 4 h en un extractor en condiciones de reflujo. El extracto se filtró a través de una tela filtrante de 10 micras. Este proceso se repitió una vez más para asegurar una extracción completa. El filtrado se reunió y se concentró en un evaporador de película limpia y se secó por aspersión con una temperatura del aire de entrada de 150 °C y un caudal de alimentación de 10 litros por hora. Se obtuvo un polvo de color marrón claro a oscuro con un rendimiento del 11% en base seca.

Se analizó sus constituyentes en una suspensión de WSWPE de concentración 100 mg/ml en metilcelulosa al 0,5%, inmediatamente después de su preparación y después de retenerla durante 24 h a temperatura ambiente. Para la preparación de la solución de prueba, se agregaron 10 ml de metanol a 1,0 g de la suspensión. Luego, la solución se centrifugó durante 5 minutos a 5000 rpm y se filtró usando un filtro de nailon de 0,44 µm. Los estándares empleados incluyeron Withanoside IV y Withanolide A, procedentes de Natural Remedies, India. Se prepararon soluciones madre de ambos estándares (Concentración: 1000 µg/mL) disolviendo estándares pesados ​​con precisión en metanol. Las soluciones madre del estándar se diluyeron aún más para preparar soluciones de 100 µg/ml. El análisis por cromatografía de ultra alto rendimiento (UHPLC) se realizó en el sistema Prominence-XR UHPLC (Shimadzu, Japón) equipado con un detector de matriz de fotodiodos. Un sistema de disolvente en gradiente de disolvente A: preparado disolviendo 0,14 g de dihidrógenofosfato de potasio en 900 ml de agua con la adición de 0,5 ml de ácido ortofosfórico y luego diluido hasta 1000 ml con agua; y se utilizó disolvente B: acetonitrilo. El programa de elución en gradiente utilizado durante el análisis consistió en 5 a 45 % de B durante 0 a 18 min, 45 a 80 % de B de 18 a 25 min, 80 % de B de 25 a 28 min, 80 a 5 % de B de 28 a 30 min. , 5% B de 30 a 40 min. Para la separación cromatográfica se utilizó el Shodex C18 4E (5 µm, 4,6 × 250 mm) (Shodex, Japón) con un caudal de 1,5 ml/min. La detección cromatográfica de todos los analitos se realizó utilizando un detector PDA a 227 nm. La temperatura de la columna se mantuvo a 27 °C y el volumen de inyección de muestra fue de 20 µL.

La identificación de los analitos se realizó sobre la base del tiempo de retención relativo (RRT), donde el pico de Withanolida A se usó como referencia y se consideró como 1,0 RRT, mientras que 0,70, 0,75, 0,80, 0,89, 0,89, 0,92, 0,96, 1,01 y 1,14 fueron los TRR de Withanoside IV, Physagulin D, 27-hidroxiwithanona, Withanoside V, Withaferin A, 12-desoxiwithastramonolide, Withanona y Withanolide B, respectivamente.

La concentración de los analitos individuales en la suspensión de WSWPE se calculó según su categoría, que es agliconas de withanolida y glucósidos de withanolida. Las agliconas de withanolida, incluidas Withaferina A, 12-desoxiwithastramonolida, Withanolida A, Withanona y Withanolida B, se calcularon frente a la muestra estándar de Withanolida A, mientras que los glucósidos de Withanolida (Withanoside IV, Withanoside V y Withanoside VI) se calcularon frente a la muestra estándar de Withanolide IV.

La evaluación de seguridad no clínica de WSWPE se llevó a cabo en la Organización de Investigación y Desarrollo Preclínico (PRADO), Private Limited, Pune, India. La instalación de pruebas está certificada por la Autoridad Nacional de Monitoreo del Cumplimiento de BPL (NGCMA), Departamento de Ciencia y Tecnología del Gobierno de la India (GLP/C-127/2018; GLP/C-168/2021); y por el Comité para el Control y Supervisión de Experimentos con Animales (CPCSEA; número de registro: 1723/PO/RcBiBt/S/13/CPCSEA), Departamento de Ganadería y Lechería, Ministerio de Pesca, Ganadería y Lechería, Gobierno de India. Se suministró a PRADO un elemento de prueba codificado para realizar el estudio y, por lo tanto, la evaluación de la seguridad no clínica de WSWPE se realizó de forma ciega en las instalaciones de prueba.

Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley machos y hembras (de 6 a 8 semanas de edad) del Instituto Nacional de Biociencias, Pune, India (Número de registro CPCSEA: 1091/GO/Bt/S/07/CPCSEA). Las ratas asignadas a un grupo se alojaron juntas en jaulas con ventilación individual (Optirat® Plus, Animal Care Systems, Inc., EE. UU.; dimensiones de la jaula: 41 cm × 41 cm × 78 cm) con mazorca de maíz esterilizada como material de cama. La temperatura en la sala de animales de experimentación se mantuvo entre 20,6 y 22,7 °C mientras que la humedad relativa varió del 40 al 62%. Los cambios de aire en la sala de los animales variaron de 10 a 15 por hora y el fotoperíodo fue un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. A los animales se les ofreció dieta granulada para animales de laboratorio (Nutrivet Lifescience, India) ad libitum, que fue esterilizada con luz ultravioleta. Además, se les suministró agua potable irradiada con luz ultravioleta y purificada por ósmosis inversa en botellas de polipropileno esterilizadas con vapor. Después de recibir los animales de experimentación del proveedor, las ratas fueron trasladadas a una sala de cuarentena, donde permanecieron alojadas durante un período de cinco días.

Los procedimientos experimentales y las prácticas de cría de animales se ajustaban estrictamente a los estándares CPCSEA9 y se contaba con la aprobación del Comité Institucional de Ética Animal (IAEC) del sitio del estudio (ver Protocolo Número: IAEC-20-068), antes del comienzo del estudio. . Además, el estudio se realizó de conformidad con las directrices ARRIVE10.

La evaluación de seguridad no clínica de WSWPE se realizó de acuerdo con la directriz de prueba número 407 de la OCDE.

Una vez finalizado el período de cuarentena, el Centro de Investigación Animal asignó 32 machos y 32 hembras respectivamente. Posteriormente, los animales fueron trasladados a una sala experimental destinada al estudio, donde se sometieron a aclimatación durante cinco días más. Durante la fase de aclimatación, las ratas se diferenciaron mediante marcas en las puntas de la cola.

Los animales se sometieron a una evaluación clínica exhaustiva, tras lo cual se pesaron utilizando una balanza para animales. Posteriormente, se asignaron aleatoriamente 30 machos y 30 hembras a los grupos de estudio, en función de su peso corporal, como se menciona en la Figura complementaria S1. Todos los grupos de estudio estaban compuestos por cinco ratas machos y cinco hembras. A los animales se les designó un número de animal permanente y se les marcó en la base de la cola. Al inicio del experimento, la variación en el peso corporal de los animales de ambos sexos, no superó el ± 20% del peso promedio. Después de la aleatorización, los animales de experimentación fueron sometidos a un examen oftalmoscópico empleando un oftalmoscopio, luego de inducir midriasis con solución de tropicamida al 1%.

Se pesó WSWPE y luego se dispensó en un mortero. Luego se sometió a trituración con un mortero, tras lo cual se añadió una pequeña cantidad de metilcelulosa al 0,5% (Loba Chemie Private Limited, India) con mezcla constante. Posteriormente se añadió gota a gota el volumen restante del vehículo con agitación continua para obtener una suspensión homogénea. Todas las formulaciones se prepararon frescas, durante toda la fase de administración del compuesto.

A las ratas asignadas al grupo G2 (dosis baja), G3 (dosis media), G4 (dosis alta) y G4R (dosis alta-recuperación) se les administró una dosis de 100, 300, 1000 y 1000 mg/kg/día, respectivamente, por vía oral. ruta. Los animales de control del brazo principal (G1) así como del brazo de recuperación (G1R) recibieron 0,5% de metilcelulosa. El volumen de dosis se fijó en 10 ml/kg de peso corporal.

Los animales fueron monitoreados una vez al día para detectar el desarrollo de signos clínicamente anormales y dos veces al día para detectar cualquier manifestación de morbilidad o mortalidad. Después de finalizar la fase de administración de vehículo/extracto, la duración de la observación se amplió durante 14 días adicionales, para los animales asignados al brazo de recuperación (G1R y G4R respectivamente). Los signos clínicos se registraron según su aparición, gravedad, duración y reversibilidad. Las ratas fueron evaluadas una vez por semana para realizar observaciones clínicas detalladas hasta la finalización del experimento, en ambos brazos del estudio. Los exámenes abarcaron cambios en la piel, pelaje, ojos y membranas mucosas, aparición de secreciones y excreciones y observaciones básicas de la actividad autónoma8.

Los animales se pesaron los días 1, 8, 15, 22 y 28 para el brazo principal del estudio. En el brazo de recuperación, también se pesaron las ratas los días 35 y 42. Además, el día de la necropsia también se documentaron los pesos corporales en ayunas de los animales tanto en el brazo principal como en el de recuperación.

La ingesta de alimentos en diferentes grupos de estudio se registró una vez por semana. El consumo de alimentos per cápita durante una semana se obtuvo empleando la siguiente fórmula:

Las ratas asignadas al grupo principal del estudio, a las que se les administró el vehículo (G1) y la dosis alta de WSWPE (G4), fueron examinadas para detectar cualquier anomalía ocular relacionada con el extracto en la cuarta semana del estudio. Se indujo midriasis en los animales con una solución de tropicamida al 1%, después de lo cual se observaron ambos ojos utilizando un oftalmoscopio. Este examen no se realizó en animales que recibieron la dosis baja y media del extracto, ya que no se observaron cambios relacionados con el WSWPE. en animales del grupo de dosis altas.

En los días 28 y 42, los animales asignados a diferentes grupos en el brazo principal y en el de recuperación respectivamente estuvieron en ayunas durante la noche. Posteriormente, los días 29 y 43, se extrajo sangre de los senos retroorbitarios de las ratas bajo anestesia transitoria con isoflurano para evaluar el efecto de WSWPE sobre los parámetros hematológicos, de coagulación y de química clínica.

La sangre se distribuyó en viales que contenían ácido etilendiaminotetraacético y sal dipotásica como anticoagulante. Después de una mezcla adecuada, la sangre se aspiró en un analizador automático Sysmex XP-100 (Sysmex Corporation, Japón) y se cuantificaron los siguientes parámetros: recuento de glóbulos rojos (RBC), hematocrito (HCT), volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina. (HGB), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), recuento de plaquetas (PLT) y recuento de glóbulos blancos (WBC). La enumeración diferencial de leucocitos y reticulocitos se realizó manualmente en frotis de sangre teñiéndolos con tinción de Giemsa y nuevo azul de metileno, respectivamente.

La sangre completa se recogió en tubos con citrato de sodio añadido. El tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) se evaluaron en el analizador de coagulación Erba ECL-105 (Erba Mannheim, Alemania).

La sangre se transfirió a viales que contenían heparina para la separación del plasma y a tubos sin anticoagulante para la separación del suero, respectivamente. El plasma y el suero se obtuvieron por centrifugación (3000 revoluciones por minuto durante 10 min). Los sueros se emplearon para el análisis de electrolitos, a saber. Sodio (Na+), Potasio (K+) y Cloruro (Cl−), utilizando un analizador de electrolitos Sensacore ST-200CL (Sensacore, India). Las muestras de plasma se utilizaron para estimar los siguientes parámetros empleando un analizador automático Erba EM Destiny 180 (Erba Mannheim, Alemania): glutamato oxalacetato transaminasa (GOT o AST), glutamato piruvato transaminasa (GPT o ALT), fosfatasa alcalina. (ALP), bilirrubina total (BILT), nivel de urea en sangre (BUL), nitrógeno ureico en sangre calculado (BUN), creatinina (CREAT), glucosa (GLU), colesterol total (CHOLE), proteína total (PRO), albúmina (ALB). ) y Relación Proteína: Albúmina (PAR).

Los parámetros de análisis de orina cualitativos se midieron en muestras de orina durante la noche obtenidas de todos los animales asignados a los distintos grupos tanto en el brazo principal como en el de recuperación durante la última semana de los períodos de tratamiento y recuperación, respectivamente, mediante el empleo de jaulas metabólicas para la recolección de orina y el analizador de orina Erba LAURA SMART. (Erba Mannheim, Alemania) para su análisis. Los parámetros evaluados fueron: Bilirrubina (BIL), glucosa (GLU), proteína (PRO), pH y gravedad específica (SG). Además, la orina se examinó manualmente para determinar su color y claridad.

Los animales fueron sacrificados humanamente por asfixia inducida por dióxido de carbono. Todas las ratas fueron sometidas a un examen patológico macroscópico integral, que incorporó un escrutinio exhaustivo de la superficie externa del cuerpo, todos los orificios y las cavidades craneal, torácica y abdominal con su contenido8.

Después de observaciones de patología macroscópica, se diseccionaron y recortaron el hígado, los riñones, las glándulas suprarrenales, los testículos/ovarios, el timo, el bazo, el cerebro y el corazón de todos los animales y se recortaron para eliminar cualquier tejido adherente. A continuación, se anotaron sus pesos húmedos y se pesaron conjuntamente todos los órganos emparejados. Los órganos seleccionados para pesar se transfirieron luego a una solución de formalina tamponada neutra al 10%, excepto los testículos que se fijaron con fijador de Davidson modificado. El peso relativo del órgano, expresado como porcentaje del peso corporal en ayunas, se calculó para cada animal individual empleando la siguiente fórmula :

También se recogieron los siguientes órganos de todos los animales y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % para el siguiente examen microscópico: aorta, hueso (médula ósea), cerebro, cerebelo, mesencéfalo, epidídimo, esófago, intestino grueso, pulmones, ganglios linfáticos (mesentéricos). ), Páncreas, Nervio ciático, Hipófisis, Vesícula seminal, Próstata, Músculo esquelético, Piel, Intestino delgado, Estómago, Médula espinal, Tiroides y paratiroides, Tráquea, Vejiga urinaria, Vagina, Útero y Glándulas mamarias. Para la fijación de los ojos se utilizó Fijador de Davidson Modificado.

Los órganos fijos de los animales que recibieron vehículo (G1) y grupo de dosis alta (G4) de WSWPE del brazo principal del estudio se sometieron a procedimientos estándar de procesamiento de tejidos. Posteriormente, utilizando una estación de inclusión de tejidos, los tejidos se incluyeron en parafina. A partir de entonces, se obtuvieron secciones de tejido de 3 a 5 µm de espesor empleando un micrótomo y estas secciones se tiñeron adicionalmente con hematoxilina-eosina. Posteriormente, las secciones teñidas se evaluaron para detectar cualquier alteración microscópica observada utilizando un microscopio.

Los datos se expresaron como media ± desviación estándar de todos los grupos y se analizaron estadísticamente utilizando Graph Pad Prism (Versión 7.03). Para el grupo de estudio principal, los parámetros de peso corporal, hematológicos, de coagulación, bioquímica, análisis de orina (gravedad específica y pH urinario) y pesos relativos de los órganos se analizaron mediante ANOVA unidireccional. Cuando se encontró que ANOVA era estadísticamente significativo, se empleó la prueba de comparación múltiple de Dunnett como prueba post-hoc para determinar los grupos que eran significativamente diferentes de los grupos administrados con vehículo al nivel del 5%, es decir, p < 0,05. Para el brazo de recuperación, los parámetros antes mencionados se analizaron empleando la prueba t de Student para detectar cualquier diferencia significativa al nivel del 5 % entre el grupo que recibió el vehículo (G1R) y el grupo que recibió la dosis alta de WSWPE (G4R).

Como se ilustra en la Fig. 1, el cromatograma UHPLC muestra que la suspensión formulada de WSWPE, destinada a la administración oral a ratas, constaba de withanósido IV, withaferina A, 12-desoxiconastramonólido, withanolido A, withanona, withanolido B, withanolido V y VI. Se informa que estos fitoconstituyentes detectados en la suspensión están presentes en Withania somnifera2, lo que caracteriza claramente el extracto químicamente.

Cromatograma UHPLC de fitoconstituyentes presentes en una suspensión de WSWPE preparada empleando 0,5% de metilcelulosa, inmediatamente (A) y después de retenerla durante 24 h a temperatura ambiente (B).

Las concentraciones de withanósido IV en la etapa inicial y 24 h después de mantener la suspensión a temperatura ambiente fueron de 0,122 mg/ml y 0,106 mg/ml respectivamente (Tabla complementaria S1). Además, la concentración de Withaferin A en los dos puntos temporales antes mencionados fue de 0,257 y 0,211 mg/ml, respectivamente (Tabla complementaria S1). La concentración de withanólidos totales en la suspensión fue de 0,885 mg/ml, inmediatamente después de la preparación y de 0,735 mg/ml después de 24 h (Tabla complementaria S1). En consecuencia, WSWPE se mantuvo estable en el vehículo durante al menos 24 h a temperatura ambiente (Fig. 1, Tabla complementaria S1). Sin embargo, en el presente estudio, hemos utilizado particularmente suspensiones recién preparadas para administrarlo a las ratas cada día durante la fase de administración del compuesto.

WSWPE administrado por vía oral no provocó mortalidad, morbilidad ni síntomas clínicos anormales, tanto en ratas macho como hembra que fueron asignadas a los grupos de tratamiento de 28 días y de recuperación de 14 días (Tabla complementaria S2). Además, los exámenes clínicos detallados, que se realizaron cada semana, no revelaron ninguna anomalía clínica que pudiera estar asociada con el extracto en ningún animal durante la duración del estudio (Tabla complementaria S3).

En comparación con sus respectivos grupos de control, la administración oral de WSWPE no produjo ningún cambio estadísticamente significativo en los pesos corporales absolutos de los animales de ambos sexos, asignados tanto al grupo principal como al de recuperación (Fig. 2A, B). Asimismo, el consumo semanal de alimentos en las ratas de todos los grupos de tratamiento fue comparable (Fig. 2C, D).

Peso corporal (media ± desviación estándar) e ingesta de alimentos (media) de ratas macho (A, C, respectivamente) y hembra (B, D, respectivamente), administradas por vía oral con WSWPE en dosis de 0, 100, 300 y 1000 mg. /kg/día, durante 28 días seguidos de un período de recuperación sin tratamiento de 14 días como se detalla en los métodos.

Las ratas de ambos sexos, que fueron asignadas a los grupos de control y de dosis alta, del estudio principal, fueron evaluadas para detectar cualquier resultado ocular anómalo en la última semana de administración del compuesto/vehículo. WSWPE no produjo ninguna anomalía notable (Tabla complementaria S4), en comparación con el grupo administrado por vehículo. En consecuencia, los animales a los que se les administró la dosis baja y media del extracto no fueron examinados.

Los parámetros hematológicos en los animales tanto del grupo de tratamiento de 28 días como del de recuperación de 14 días, que recibieron WSWPE, fueron, en su mayor parte, similares a sus respectivos grupos de control (Tabla 1). Sin embargo, entre las ratas asignadas a los principales grupos de estudio, se observó un aumento estadísticamente significativo en el recuento de glóbulos blancos y el volumen corpuscular medio junto con una disminución significativa en el recuento de plaquetas en las ratas macho, a las que se les administró la dosis media de WSWPE (300 mg/kg/día), en comparación con el grupo control (p < 0,05). Estas observaciones no pueden vincularse directamente con la administración de WSWPE debido a la falta de dependencia de la dosis y, en consecuencia, pueden clasificarse como hallazgos incidentales. En el grupo de recuperación, los animales machos a los que se administró WSWPE demostraron una disminución estadísticamente significativa (p <0,05) en el recuento total de eritrocitos y el hematocrito en comparación con el grupo de control. Estos hallazgos no pueden atribuirse explícitamente a WSWPE ya que se encuentran dentro de los rangos de referencia históricos para los animales de control11 y en el sitio de estudio. Además, estos hallazgos no fueron corroborados en las hembras asignadas al grupo de recuperación.

En los animales del género femenino que fueron asignados al estudio principal, el hematocrito fue significativamente elevado (p < 0,05) en las ratas a las que se les administró la dosis media de WSWPE (300 mg/kg/día), en comparación con el vehículo. -grupo administrado. Además, en comparación con el grupo control, el volumen corpuscular medio disminuyó significativamente (p < 0,05) en los animales que recibieron la dosis baja (100 mg/kg/día), pero fue significativamente mayor (p < 0,05) en las ratas que recibieron la dosis media (300 mg/kg/día) y la alta (1000 mg/kg/día) de WSWPE, respectivamente. Además, la concentración media de hemoglobina corpuscular aumentó significativamente (p < 0,05) en los animales a los que se les administró la dosis baja (100 mg/kg/día), pero disminuyó significativamente en los animales que recibieron la dosis media (300 mg/kg/día) y alto (1000 mg/kg/día) del extracto. Todas estas alteraciones observadas en mujeres no pueden atribuirse a WSWPE ya que no dependían de la dosis. Además, es poco probable que tengan importancia clínica ya que los valores se encuentran dentro de los rangos de referencia históricos para los animales de control y en el sitio del estudio.

Finalmente, no se observaron cambios macroscópicos o histopatológicos en el bazo o la médula ósea de los animales que recibieron la dosis alta de WSWPE, lo que podría dilucidar estos resultados hematológicos tanto en ratas macho como hembra.

Este estudio también examinó el efecto de WSWPE sobre los parámetros de coagulación sanguínea, incluido el tiempo de protrombina y el tiempo de tromboplastina parcial activada. Ambos parámetros estudiados no se vieron afectados en gran medida después de la administración oral de WSWPE tanto en hombres como en mujeres, tanto en el brazo principal como en el de recuperación (Tabla 1). Sin embargo, en comparación con el grupo de control, se observó una disminución menor, pero estadísticamente significativa (p < 0,05) en el tiempo de protrombina tanto en ratas macho como hembra asignadas al brazo principal del estudio, a las que se les administró la dosis alta de WSWPE (1000 mg). /kg/día). En las hembras asignadas al grupo de recuperación, se observó un aumento significativo (p < 0,05) en el tiempo de tromboplastina parcial activada en los animales a los que se administró WSWPE. Es poco probable que estos hallazgos tengan importancia clínica ya que los valores están dentro de los rangos de referencia descritos para ratas SD y en el sitio del estudio.

Los parámetros de química clínica en general no se modificaron después de la administración oral de WSWPE tanto en animales machos como hembras (Tabla 2). Sin embargo, en los animales machos asignados a los grupos de tratamiento de 28 días, se observó un aumento significativo (p < 0,05) en los niveles de colesterol en las ratas que recibieron la dosis baja (100 mg/kg/día) y alta (1000 mg/kg/día). día) de WSWPE respectivamente, en comparación con los grupos de control. Además, en comparación con el grupo de control, se detectaron niveles séricos significativamente elevados de Na+ en ratas a las que se les administró la dosis media (300 mg/kg/día) del extracto (p < 0,05). Sin embargo, estos cambios observados no estuvieron relacionados con la dosis. Además, la administración de WSWPE a ratas macho a una dosis de 1000 mg/kg/día produjo un aumento significativo en el nivel de bilirrubina total (p <0,05), en comparación con el grupo de control. Este efecto, aunque está relacionado con la dosis, es poco probable que tenga relevancia clínica ya que el nivel registrado estuvo dentro del rango de referencia descrito para las ratas SD y en el sitio del estudio. De manera similar, en el grupo de recuperación se detectó un aumento significativo en el valor de la fosfatasa alcalina (p < 0,05) en los animales a los que se administró WSWPE, en comparación con el grupo de control y este nivel también estuvo dentro de los rangos de referencia históricos, eliminando así el riesgo de una posible traducción a cualquier consecuencia clínica.

En las hembras asignadas al grupo principal del estudio, se observó una elevación significativa en el nivel de bilirrubina total en las ratas (p < 0,05) que recibieron la dosis media (300 mg/kg/día) de WSWPE. Sin embargo, este hallazgo no dependió de la dosis. En las ratas hembras asignadas al grupo de recuperación, se observó una disminución estadísticamente significativa (p < 0,05) en el nivel sérico de Na+, en comparación con el grupo de control correspondiente. Sin embargo, este cambio estuvo dentro del rango de referencia y en el sitio del estudio.

La administración oral de WSWPE en ratas de ambos sexos, asignadas a los brazos del estudio principal y de recuperación, no tuvo un efecto significativo sobre los parámetros del análisis de orina en comparación con sus respectivos grupos de control (Tabla 3).

Los pesos relativos de los órganos de las ratas macho y hembra administradas con WSWPE, asignadas tanto al grupo principal como al de recuperación, fueron comparables a los de sus respectivos grupos de control (Tabla 4).

El examen macroscópico de los órganos extraídos de ratas macho y hembra que recibieron WSWPE no reveló ninguna lesión de relevancia patológica, tanto en el grupo de tratamiento de 28 días como en el grupo de recuperación de 14 días (Tabla complementaria S5).

La evaluación microscópica de los tejidos se realizó en ratas macho y hembra del grupo de estudio principal, a las que se les administró el vehículo y la dosis alta de WSWPE (1000 mg/kg/día), respectivamente. Los animales que recibieron la dosis alta de WSWPE no mostraron ninguna característica histológica anormal que pueda atribuirse específicamente al extracto (Fig. 3 y Fig. 4; Tabla complementaria S6).

Fotomicrografías histológicas representativas de órganos seleccionados de ratas que recibieron por vía oral el vehículo (0,5 % metilcelulosa) o la dosis alta (1000 mg/kg/día) de WSWPE durante una duración total de 28 días consecutivos, en este estudio de seguridad no clínico. Las secciones de tejido se han teñido con hematoxilina y eosina. Se han procesado los siguientes órganos para obtener imágenes: cerebro, pulmón, médula ósea (× 100); Hígado, Riñón, Corazón, Músculo Esquelético, Testículos, Ovario (× 400).

Fotomicrografías histológicas representativas de órganos seleccionados de ratas que recibieron por vía oral el vehículo (0,5 % metilcelulosa) o la dosis alta (1000 mg/kg/día) de WSWPE durante una duración total de 28 días consecutivos, en este estudio de seguridad no clínico. Las secciones de tejido se han teñido con hematoxilina y eosina. Glándula suprarrenal (× 40); Tráquea, Vejiga Urinaria, Útero (× 100); Pituitaria, Páncreas, Tiroides, Vesícula Seminal, Próstata, Glándula Mamaria (× 400).

Aunque las raíces de la planta Withania somnifera se utilizan principalmente para la preparación de formulaciones ayurvédicas clásicas, las investigaciones científicas modernas sugieren que las partes aéreas de la planta, es decir, sus hojas, tallo, frutos y semillas, también poseen varios fitoconstituyentes biológicamente activos. Se han estudiado con resultados positivos las actividades farmacológicas preclínicas in vitro e in vivo de dichas partes aéreas. Para profundizar más, los extractos de hojas de la planta Withania somnifera han demostrado preclínicamente varias actividades farmacológicas como anticancerígenas12,13,14,15,16, antineuroinflamatorias17,18, ansiolíticas e inductoras del sueño18,19, cardioprotectoras20, antidiabéticas21, 22, antimicrobiano23,24 y antiosteoporótico25. Además, en ciertos estudios, los extractos preparados a partir de las hojas han demostrado poseer una actividad superior a la de las raíces de Withania somnifera. A modo de ejemplo, se ha informado que un extracto etanólico al 50% preparado a partir de hojas y tallos de Withania somnifera posee una actividad citotóxica in vitro superior contra varias líneas celulares de cáncer humano en comparación con un extracto similar preparado a partir de las raíces26.

También se han realizado investigaciones clínicas para evaluar la eficacia y seguridad de las formulaciones de Withania somnifera, incluidas las hojas. Una de esas formulaciones que consiste en extractos combinados de hojas y raíces ha demostrado eficacia clínica para mejorar el rendimiento cognitivo y psicomotor27 y reducir el dolor, la rigidez de las articulaciones y la discapacidad en pacientes afectados por osteoartritis28. Se sabe que los extractos específicos de las bayas de Withania somnifera poseen actividades antioxidantes6 y anticancerígenas29. También se sabe que los extractos de tallo de Withania somnifera poseen actividad anticancerígena26.

Un estudio reciente ha demostrado además que los ácidos grasos extraídos de las semillas de Withania somnifera repararon lesiones cutáneas similares a la psoriasis inducidas por 12-O tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) en ratones modulando la liberación de citoquinas proinflamatorias, según se indica en -condiciones vitro7. En conjunto, además de las raíces, las otras partes aéreas de la planta Withania somnifera también tienen potencial terapéutico y profiláctico desde el punto de vista clínico.

En consecuencia, con el objetivo de respaldar las próximas investigaciones de seguridad no clínicas en no roedores y los futuros ensayos de eficacia y seguridad en seres humanos, hemos evaluado el perfil de seguridad de un extracto hidrometanólico preparado a partir de toda la planta de Withania somnifera (WSWPE). que incorpora también las raíces. Presentamos aquí por primera vez una evaluación de toxicidad subaguda basada en BPL, en la que se administró continuamente WSWPE a ratas macho y hembra por vía oral durante un período de estudio de 28 días, seguido de un período de recuperación gratuito de administración de extracto de 14 días, en un grupo satélite de animales.

En el presente estudio, posterior a la administración de WSWPE en ratas de ambos sexos, no observamos mortalidad ni signos clínicos anormales; ningún efecto significativo sobre el peso corporal y la ingesta de alimentos y sin aberraciones oftálmicas en comparación con los animales a los que se les administró el vehículo, tanto en el brazo principal como en el de recuperación. De manera similar, al finalizar el estudio, no se observaron cambios patológicos importantes en ningún órgano y se encontró que el peso de los órganos era comparable al de los animales que recibieron el vehículo solo. El examen microscópico de los órganos extraídos de los animales a los que se les administró la dosis más alta del extracto tampoco reveló ninguna alteración relacionada con el WSWPE. Asimismo, los parámetros cualitativos del análisis de orina también fueron equivalentes entre los grupos administrados con vehículo y WSWPE tanto en el brazo principal como en el de recuperación. Sin embargo, sí detectamos algunos cambios estadísticamente significativos en los parámetros hematológicos, de coagulación y de química clínica. Estas alteraciones, en nuestra opinión, no se consideraron adversas y, además, no estaban relacionadas explícitamente con WSWPE, ya que no dependían de la dosis ni eran explicables debido a la inexistencia o cualquier hallazgo macro o microscópico en los órganos extraídos en el momento. de necropsia. Además, es poco probable que los hallazgos tengan importancia clínica, ya que los parámetros evaluados en los que se observó significación estadística estaban dentro de los rangos de referencia históricos descritos para las ratas SD en el sitio del estudio. En consecuencia, como se concluyó en el estudio, se determinó que el NOAEL de WSWPE en ratas SD era de 1000 mg/kg/día.

Aunque reiteramos que el presente estudio es la primera descripción de la evaluación de seguridad no clínica de WSWPE, vale la pena describir brevemente los perfiles de seguridad no clínicos existentes, disponibles en el dominio público, para los extractos derivados de las raíces de Withania somnifera. así como sus fitoconstituyentes.

Se ha informado sobre la evaluación de la seguridad aguda y subaguda de un extracto etanólico de raíces de Withania somnifera, en la que el extracto se administró a ratones y ratas de ambos sexos, respectivamente, por vía intraperitoneal30. En el estudio de toxicidad aguda, se determinó que la LD50 del extracto de raíz era 1260 mg/kg, ip en ratones. En la evaluación de toxicidad subaguda subsiguiente, ratas Wistar machos y hembras recibieron el extracto en una dosis de 100 mg/kg, ip repetidamente durante 30 días. No se observó mortalidad en ningún animal y, en comparación con el grupo de control del vehículo, no se informaron diferencias significativas en la ingesta de alimentos y agua, así como en el aumento de peso corporal, posterior a la administración del extracto. Sin embargo, sólo se informó una disminución significativa en el peso absoluto del bazo, las glándulas suprarrenales y el timo en los animales machos. El examen de los parámetros hematológicos reveló un aumento significativo en la concentración de hemoglobina, mientras que los parámetros de química clínica se mantuvieron prácticamente sin cambios. Finalmente, no se detectaron cambios macroscópicos ni histológicos en ningún órgano en todos los animales. En otro estudio de toxicidad aguda realizado de acuerdo con la directriz 420 de la OCDE, se administraron por vía oral extractos acuosos, hidroalcohólicos y etanólicos de las raíces secas de Withania somnifera a ratones albinos hembra, y se informó que todos los extractos eran seguros hasta 2000 mg/kg. po31. En otro estudio, se administró un extracto acuoso de las raíces de las plantas a ratas Wistar macho por vía oral a una dosis de 3000 mg/kg durante siete días, en el que no se produjeron muertes relacionadas con el extracto, signos clínicos aparentes de toxicidad, estrés ni impacto adverso en los alimentos. y se detectó ingesta de agua32. La evaluación del estudio de toxicidad aguda de un extracto de raíz de Withania somnifera, estandarizado para Withaferina-A, se administró por vía oral a ratas Wistar hembra por vía oral en dosis de 500, 1000 y 2000 mg/kg33. En este estudio se informó que la LD50 era superior a 2000 mg/kg y el extracto carecía de efectos conductuales y, además, no se revelaron patologías orgánicas graves. El mismo estudio examinó además la toxicidad subaguda del mismo extracto, en ratas macho y hembra que recibieron el extracto en dosis de 500, 1.000 y 2.000 mg/kg. En este experimento tampoco se descubrieron toxicidades importantes y las alteraciones observadas en ciertos parámetros hematológicos y de química clínica estuvieron dentro de los rangos de referencia definidos para ratas, como también se observó en nuestro estudio. Además, no se revelaron patologías orgánicas macro ni microscópicas, por lo que se consideró que el NOAEL era de 2000 mg/kg. En otro estudio relacionado, se evaluó la toxicidad aguda y subaguda de un extracto hidroalcohólico preparado a partir de las raíces de Withania somnifera34 y las conclusiones del estudio fueron precisamente análogas a las del estudio citado anteriormente33. Además, un estudio evaluó la toxicidad subcrónica de un extracto puro de Withania somnifera, en el que el extracto se administró por vía oral a ratas durante un estudio de 90 días en dosis de 100, 500 y 1000 mg/kg/día35. En este estudio, se determinó que el NOAEL era de 1000 mg/kg/día ya que el extracto carecía de toxicidad aparente hasta esta dosis. Finalmente, se determinó que un extracto acuoso de raíces no era tóxico en un estudio de toxicidad crónica realizado en ratas a las que se les administraron 250 mg/kg del extracto por vía oral durante 8 meses1. Sin embargo, algunos hallazgos de este estudio fueron un aumento significativo en el peso corporal y el peso del hígado y una disminución significativa en los niveles de cortisol en plasma.

También se han realizado evaluaciones de toxicidad aguda de los componentes bioactivos de Withania somnifera, que también se han detectado en WSWPE. Se ha informado que la LD50 de Withaferina A en ratas es de 670 mg/kg por vía oral y la LD50 de Withanona se calculó en más de 400 mg/kg en ratas que recibieron el fitoconstituyente puro por vía oral1. Los altos valores de LD50 informados para Withaferin A y Withanona corroboran aún más el perfil de seguridad aceptable observado en nuestro estudio, ya que la cantidad de estos dos componentes presentes en WSWPE es solo una fracción de los valores de LD50 informados.

En comparación con el perfil de seguridad no clínico publicado del extracto de raíces, en nuestro estudio tampoco observamos ninguna toxicidad con el extracto hidrometanólico obtenido de toda la planta de Withania somnifera. Especulamos que debido a la similitud en los fitoconstituyentes de las raíces y de toda la planta, que incluyen sus partes aéreas, es decir, las hojas, el tallo, las bayas y las semillas, se puede esperar un perfil de seguridad de las partes aéreas comparable al de las raíces.

Este perfil de toxicidad subaguda aceptable observado de WSWPE permite una evaluación adicional de su seguridad no clínica en no roedores y su evaluación de toxicidad crónica y subcrónica en roedores. En última instancia, según los resultados del estudio, la eficacia y seguridad de WSWPE también se puede extender a pacientes que padecen trastornos para los cuales WSWPE tiene un valor terapéutico potencial.

La evaluación de toxicidad subaguda no clínica de WSWPE se realizó mediante su administración oral repetida a ratas Sprague-Dawley de ambos sexos durante un total de 28 días, en dosis de 100, 300 y 1000 mg/kg/día, según la prueba de la OCDE. directriz 407, en cumplimiento de los Principios de BPL de la OCDE. Además, el diseño del estudio también comprendió un brazo de recuperación en el que a ratas machos y hembras se les administró el vehículo y la dosis alta de WSWPE durante 28 días, después de lo cual se suspendió la administración del extracto y se observó en las ratas su reversión, persistencia o retrasar la aparición de cualquier resultado adverso durante 14 días adicionales. En el presente estudio, en comparación con los grupos tratados con vehículo, WSWPE no reveló ninguna alteración clínicamente significativa en los parámetros evaluados. En consecuencia, basándose en la premisa antes mencionada, se determinó que el NOAEL para WSWPE era 1000 mg/kg/día tanto en ratas macho como en hembras. En consecuencia, los resultados prevén una evaluación de seguridad no clínica adicional para WSWPE en no roedores y una mayor duración en roedores. Además, este estudio también allana el camino para la investigación detallada del extracto de planta entera de Withania somnifera en entornos clínicos.

Los datos generados para el presente estudio están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Agradecemos al Dr. Pralhad Wangikar, al Dr. Sachin Shinde, al Dr. Pradhnya Choudhary y al personal científico de PRADO, Pune, India, por realizar este estudio de toxicidad GLP; la Sra. Meenu Tomer por el apoyo a la química analítica; y al Dr. Preeti Raj y al Dr. Kunal Bhattacharya por su excelente ayuda con los gráficos. Extendemos nuestro agradecimiento al Sr. Tarun Rajput, al Sr. Gagan Kumar y al Sr. Lalit Mohan por su rápido apoyo administrativo.

División de Descubrimiento y Desarrollo de Fármacos, Instituto de Investigación Patanjali, NH-58, Roorkee-Haridwar Road, Haridwar, Uttarakhand, 249 405, India

Acharya Balkrishna, Sandeep Sinha, Jyotish Srivastava y Anurag Varshney

Departamento de Ciencias Afines y Aplicadas, Universidad de Patanjali, NH-58, Haridwar, Uttarakhand, 249405, India

Acharya Balkrishna y Anurag Varshney

Patanjali UK Trust, Glasgow, Reino Unido

Acharya Balkrishna

Centro Especial de Medicina de Sistemas, Universidad Jawaharlal Nehru, Nueva Delhi, 110067, India

Anurag Varshney

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AB proporcionó una dirección amplia para el estudio, identificó las formulaciones de prueba, generó recursos y dio la aprobación final para el manuscrito; SS supervisó el estudio in vivo, realizó la curación de datos y escribió el manuscrito; JS supervisó la caracterización química y el análisis de estabilidad de la formulación del artículo de prueba; AV monitoreó, supervisó estudios generales, generó recursos, revisó críticamente y finalmente aprobó el manuscrito. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Anurag Varshney.

Acharya Balkrishna es fideicomisario de Divya Yog Mandir Trust, Haridwar, India, que gobierna Divya Pharmacy, Haridwar. Además, Acharya Balkrishna es uno de los promotores fundadores y ocupa un puesto directivo honorario en Patanjali Ayurved Ltd, Haridwar, India. Divya Pharmacy y Patanjali Ayurved Ltd fabrican y venden comercialmente varios productos ayurvédicos. Divya Pharmacy y Patanjali Ayurved Ltd no participaron en ningún aspecto de este estudio. Todos los demás autores, Sandeep Sinha, Jyotish Srivastava y Anurag Varshney, han trabajado en el Instituto de Investigación Patanjali, gobernado por Patanjali Research Foundation Trust (PRFT), Haridwar, Uttarakhand, India, una organización sin fines de lucro. Además, Anurag Varshney es profesor adjunto en el Departamento de Ciencias Afines y Aplicadas de la Universidad de Patanjali, Haridwar, India; y en el Centro Especial de Medicina de Sistemas, Universidad Jawaharlal Nehru, Nueva Delhi, India. Todos los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

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Balkrishna, A., Sinha, S., Srivastava, J. et al. El extracto de planta entera de Withania somnifera (L.) Dunal demuestra una seguridad no clínica aceptable en una evaluación de toxicidad subaguda de 28 días en ratas según el cumplimiento de las BPL. Representante científico 12, 11047 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14944-x

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Recibido: 08 de noviembre de 2021

Aceptado: 15 de junio de 2022

Publicado: 30 de junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14944-x

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